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Device 發(fā)文:精儀系尤政課題組提出基于點(diǎn)陣光斑激發(fā)方法的高通量流式成像技術(shù)


  來(lái)源: 清華大學(xué)精密儀器系 時(shí)間:2023-12-25 編輯:清風(fēng)
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近日,清華大學(xué)精密儀器系尤政教授團(tuán)隊(duì)提出了基于點(diǎn)陣激光激發(fā)方法的高通量流式成像方法。該方法可實(shí)現(xiàn)低成本、高可擴(kuò)展性的成像流式細(xì)胞儀,而且首次驗(yàn)證了全光譜成像流式技術(shù)。相關(guān)成果以“Imaging flow cytometry using linear array spot excitation”為題在期刊《Device》上發(fā)表,并被選為當(dāng)期封面文章。



研究背景與成果


流式和顯微鏡是細(xì)胞檢測(cè)的兩個(gè)基本工具。流式技術(shù)具有高通量和豐富的分子檢測(cè)信息,但缺乏細(xì)胞形態(tài)信息;相反,熒光顯微鏡可以提供細(xì)胞影像信息,但檢測(cè)通量低,難以獲取足夠的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。自流式細(xì)胞儀問(wèn)世以來(lái),其發(fā)展趨勢(shì)一直在于保持高檢測(cè)通量的同時(shí)增加更多信息維度,例如空間形態(tài)信息或光譜信息,以實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的細(xì)胞分析或分選。成像流式技術(shù)是一種整合了流式細(xì)胞儀高檢測(cè)通量和熒光顯微鏡空間分辨能力的儀器。然而,由于成像通量、分辨率和檢測(cè)靈敏度之間的基本矛盾,現(xiàn)有的成像流式技術(shù)通常采用復(fù)雜的光路系統(tǒng)、復(fù)雜的圖像重構(gòu)算法,同時(shí)成像可擴(kuò)展性也很有限。這使得成像流式細(xì)胞儀難以達(dá)到像傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀那樣的高檢測(cè)通道數(shù),并且其高昂的技術(shù)成本限制了應(yīng)用范圍。


為解決這些問(wèn)題,清華大學(xué)精儀系尤政教授課題組提出了一種基于點(diǎn)陣激光激發(fā)的成像方法,即Linear spot array excitation(LASE)。該方法的核心思想是使用點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)光斑替代傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀中的橢圓或條狀光斑,從而賦予流式細(xì)胞儀成像能力。


圖1:點(diǎn)陣激光激發(fā)成像原理示意圖


圖1展示了該成像方法的工作原理。在檢測(cè)區(qū)域中,激發(fā)光斑呈一串等間隔的點(diǎn)陣光斑,由衍射光學(xué)器件生成,光斑間隔大于細(xì)胞大小,并且其排列直線與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)直線呈一定的小角度。當(dāng)細(xì)胞依次通過(guò)照明光斑時(shí),將產(chǎn)生一串熒光和散射光信號(hào)。在圖像重構(gòu)階段,只需通過(guò)信號(hào)的分割和重組即可重建細(xì)胞圖像。該方法具有實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)重建的優(yōu)勢(shì),并且與現(xiàn)有流式細(xì)胞儀光路結(jié)構(gòu)兼容,因此具有良好的可擴(kuò)展性,能夠在高檢測(cè)通量的基礎(chǔ)上,同時(shí)實(shí)現(xiàn)多激光、多熒光通道以及無(wú)標(biāo)記成像。


技術(shù)成果展示


圖2. 雙激光五通道成像流式系統(tǒng)


圖3.細(xì)胞器進(jìn)行成像與細(xì)胞周期研究


本研究利用基于LASE成像方法構(gòu)建了一個(gè)成像系統(tǒng),具備2色激光(488nm/638nm)和5個(gè)成像通道(明場(chǎng)、FITC、PE、PI、APC),如圖2A所示。該系統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)證在30×30μm的成像視場(chǎng)下,具有1.3μm的空間分辨率。當(dāng)細(xì)胞樣本以5m/s的流速經(jīng)過(guò)探測(cè)區(qū)域后,系統(tǒng)能夠進(jìn)行無(wú)標(biāo)記的明場(chǎng)成像和熒光成像,且不會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)模糊,成像通量最高可達(dá)每秒5000個(gè)細(xì)胞每秒。該系統(tǒng)不僅能夠?qū)?xì)胞中的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像(見(jiàn)圖3A),而且可以在多個(gè)熒光波段下,實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時(shí)成像(見(jiàn)圖3B)。在生物學(xué)應(yīng)用中,圖像被廣泛視為金標(biāo)準(zhǔn),因?yàn)樗軌驗(yàn)榧?xì)胞分析提供更為豐富和準(zhǔn)確的信息,從而更細(xì)致準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)胞分型。舉例來(lái)說(shuō),通過(guò)圖像,可以在傳統(tǒng)流式基礎(chǔ)上更進(jìn)一步區(qū)分細(xì)胞周期M期的細(xì)胞核形態(tài),如圖3C所示。


圖4. 32通道全光譜成像流式驗(yàn)證


得益于LASE成像方法的高度可擴(kuò)展性,本論文將成像熒光信號(hào)引入一個(gè)基于棱鏡色散的32通道光譜儀中,初步驗(yàn)證了全光譜成像流式細(xì)胞儀的可行性。該系統(tǒng)在保持每秒5000個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)速度通量的同時(shí),能夠同時(shí)在32個(gè)光譜通道上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。借助光譜分解算法,可以有效解決多染料檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中染料光譜混疊效應(yīng)的問(wèn)題,將成像流式細(xì)胞儀的理論可檢測(cè)染料數(shù)擴(kuò)展至30以上的量級(jí)。這將大大提高成像流式細(xì)胞儀給單細(xì)胞分析帶來(lái)的信息量。


成果優(yōu)勢(shì)


該研究提出的點(diǎn)陣激光激發(fā)的成像方法,具有以下優(yōu)勢(shì):


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